Китайские ученые создали метод микроскопии без лазерного возбуждения
Исследователи из Китая разработали новый метод микроскопии сверхвысокого разрешения, который не требует лазерного возбуждения, вместо этого применяя свет, возникающий в результате химических реакций. Новый алгоритм реконструкции позволяет изучать внутриклеточные структуры с разрешением около 100 нанометров и непрерывно наблюдать за живыми клетками в течение 41 часа. Работа опубликована в журнале Nature. Об этом сообщает сайт N + 1.
Традиционная микроскопия сверхвысокого разрешения основана на лазерном возбуждении флуоресцентных меток, что создает определенные ограничения. Главная проблема заключается в том, что яркий и продолжительный свет лазера приводит к быстрому выцветанию меток и повреждению клеток. Химическое свечение, в отличие от лазера, не имеет фонового засвета и менее вредно для клеток, однако количество фотонов от одной реакции невелико, что требует длительной выдержки для получения снимка, что затрудняет достижение сверхвысокого разрешения, обычно достигаемого за счет анализа множества кадров.
Цзяньдун Фэн из Чжэцзянского университета и Харбинского технологического института и его коллеги нашли решение этой проблемы. Их метод записывает последовательность кадров свечения и выявляет корреляции между соседними пикселями в мерцании отдельных молекул-излучателей. Этот подход напоминает флуктуационную флуоресцентную микроскопию, но адаптирован для химического свечения. Для устранения неравномерности свечения по полю зрения исследователи добавили карту энтропии, которая показывает расположение излучающих молекул и позволяет корректировать корреляционный анализ, после чего восстанавливается изображение с использованием деконволюции с ограничениями на разреженность и непрерывность сигнала.
В электрохемилюминесцентной (ЭХЛ) микроскопии авторы улучшили химию свечения, заменив стандартный трипропиламин на бис(2-гидроксиэтил)амино-трис(гидроксиметил)метан, что увеличило яркость ЭХЛ-изображений клеток примерно в 1000 раз. Это улучшение объясняется длительным временем жизни радикала и увеличенным расстоянием диффузии, что повышает вероятность его взаимодействия с органеллами, меченными Ru(bpy)32+. Новый метод позволил получить разрешение 97 нанометров для микротрубочек клетки, сопоставимое с современными флуоресцентными методами, всего за 100 кадров с выдержкой 20 миллисекунд каждый. Метод также успешно справился с трехмерной реконструкцией, что было одной из главных технических проблем ЭХЛ-микроскопии. Постепенно увеличивая напряжение на электроде вместе с изменением фокуса, исследователи различили микротрубочки, находящиеся на расстоянии 235 нанометров по глубине и 116 нанометров в плоскости кадра. Новый ЭХЛ-метод также подходит для больших полей зрения: изображение площадью 0,53 × 0,53 квадратного миллиметра, полученное из девяти сшитых кадров, имеет среднее разрешение 153 нанометра.
Поскольку ЭХЛ-реакция происходит на поверхности электрода, метод особенно чувствителен к структурам у поверхности клетки. Это позволило достичь сверхчувствительной визуализации белка-маркера раково-эмбрионального антигена, с порогом обнаружения, в восемь раз ниже, чем у флуоресцентного сверхразрешения благодаря отсутствию автофлуоресцентного фона.
Аналогичный подход был применен к хемилюминесценции и биолюминесценции с использованием ферментативной системы на основе люциферазы NanoLuc и флуоресцентного белка mNeonGreen с субстратом фурфуримазином. Для хемилюминесцентной съемки фиксированных клеток новый метод обеспечил трехмерную реконструкцию митохондрий с разрешением 102 нанометра в плоскости кадра и 221 нанометр по глубине. Для биолюминесценции в живых клетках метод достиг разрешения 117 нанометров при съемке микрофиламентов, эндоплазматического ретикулума и микротрубочек, что значительно превосходит обычные методы биолюминесцентной микроскопии, ограниченные дифракционным пределом.
Главное преимущество биолюминесценции заключается в полном отсутствии лазера, что исключает фотоповреждения и выцветание меток. В сравнении со структурированным освещением, одним из стандартных методов сверхразрешения для живых клеток, разница значительна: под непрерывным лазером уже за 18 минут теряется большая часть сигнала, тогда как новый метод на биолюминесценции сохраняет стабильную яркость в течение нескольких часов. Это позволило непрерывно снимать живые клетки с высоким разрешением на протяжении 41 часа без потери контраста и интенсивности свечения. Ученые смогли проследить за движением отдельных митохондрий с разрешением 104 нанометра, установив, что они движутся быстрее у края клетки и медленнее около ядра, а после примерно 25 часов съемки их количество начинает снижаться, а средний диаметр увеличивается, что может указывать на признаки апоптоза. Также исследователи наблюдали, как митохондрии передаются от одной клетки к другой, выделив два типа движения: «прямое» — с почти прямолинейными траекториями и равномерной скоростью, и «непрямое» — более сложное, с остановками и последующим направленным движением к клетке-реципиенту.
Авторы подчеркивают, что их метод не заменяет флуоресцентную микроскопию сверхвысокого разрешения, а лишь компенсирует ее недостатки: флуоресцентные методы обеспечивают субнанометровую локализацию, но плохо подходят для больших полей зрения и длительных съемок, в то время как быстрые флуоресцентные методы для живых клеток обычно имеют умеренное разрешение. Новый метод занимает промежуточную позицию, сочетая приемлемое разрешение, большое поле зрения и значительно более длительное время съемки живых клеток.
