Фертильных мышей обоих полов создали с использованием мужского генома
Японские ученые смогли изменить пол эмбрионов мышей с мужского на женский, удалив Y-хромосому на ранних стадиях развития с помощью CRISPR-Cas9. Объединив эту методику с усовершенствованным переносом ядер соматических клеток, они получили фертильное потомство обоих полов, используя исключительно геном самцов. Препринт исследования доступен на bioRxiv. Данную информацию сообщает портал N + 1.
Пол млекопитающих определяется парами половых хромосом: XX — женский, XY — мужской. Все эмбрионы изначально развиваются по женскому типу, но ген SRY, расположенный в Y-хромосоме, блокирует формирование женских половых органов и инициирует развитие мужских. В отсутствие этого гена у мышиных эмбрионов с кариотипом XY они развиваются как самки с яичниками, однако эти органы часто имеют структурные и функциональные аномалии, что приводит к бесплодию. В то же время самки с одной X-хромосомой (кариотип X0) являются здоровыми и фертильными. Похожие явления наблюдаются и у других животных. Таким образом, удаление Y-хромосомы на ранних стадиях эмбрионального развития может привести к образованию фертильных самок из мужского генома с использованием технологии переноса ядер соматических клеток. Это может быть особенно важно для восстановления популяций исчезающих видов, где недостаточно самок для поддержания генетического разнообразия.
Такаси Исиути из Университета Яманаси и его команда исходили из того, что инактивация центромеры Y-хромосомы в оплодотворенной яйцеклетке препятствует ее передаче следующим клеточным поколениям. Они применили систему редактирования генома CRISPR-Cas9, создав три независимые гидовые РНК, нацеленные на центромеру Y-хромосомы, и выбрали наиболее эффективную из них (Y3). Использование CRISPR-Cas9 с этой гРНК позволило стабильно удалить Y-хромосому в клеточных культурах, что авторы назвали Y-CUT. Применение этого метода к мышиным зиготам дало потомство, состоящее только из самок, около 43 процентов из которых имели кариотип X0.
В ходе экспериментов выяснили, что инбредные лабораторные мыши с Y-хромосомой от подвида Mus musculus domesticus более чувствительны к Y-CUT, чем от подвида Mus musculus musculus, что привело к дальнейшим испытаниям с этими линиями. Для отслеживания судьбы Y-хромосомы после применения Y-CUT к зиготе исследователи использовали флуоресцентную гибридизацию ДНК in situ (DNA-FISH). Выяснилось, что начиная со стадии двух клеток, Y-хромосома секвестрируется в одно или два микроядра, и к стадии морулы практически полностью локализуется в них. Позже эти микроядра, вероятно, деградируют через аутофагию, так как на более поздних стадиях они не обнаруживаются.
При стандартном применении переноса ядер соматических клеток пол клонов совпадает с полом донора ядра. Чтобы получить потомство обоих полов только из ядер самца, авторы использовали оптимизированный протокол переноса с ингибиторами HDAC и G9a для повышения эффективности. После переноса ядер клеток Сертоли новорожденного самца к эмбрионам с помощью электропорации применили Y-CUT. В результате было получено 13 эмбрионов (уровень рождаемости среди перенесенных эмбрионов составил 11 процентов), из которых 10 оказались самками с кариотипом X0. Все особи обоих полов достигли взрослого состояния и при скрещивании дали потомство. У самок этого потомства был нормальный кариотип XX, что подтверждает восстановление нормального хромосомного набора при половом размножении.
Данная процедура была успешно воспроизведена с использованием ядер клеток крови или фибробластов взрослого самца, а также криоконсервированных клеток крови. Во всех случаях получалось здоровое фертильное потомство обоих полов — мужского без применения Y-CUT и преимущественно или исключительно женского после его использования. Анализ кариотипов клеток клонов методом FISH показал, что Y-CUT селективно удаляет Y-хромосому без дополнительных транслокаций и признаков мозаицизма. Полногеномное секвенирование подтвердило нормальное количество аутосом и X-хромосому при полном отсутствии Y-хромосомы у клонированных самок с кариотипом X0. Нетаргетные события были зарегистрированы менее чем в одном проценте проверенных локусов и представляли собой мозаичные мутации из инделов длиной 1–10 пар оснований вне экзонных областей.
В завершение исследователи проверили возможность генетического кодирования Y-CUT для создания программируемой платформы для элиминации Y-хромосомы in vivo. Для этого они создали генно-модифицированных мышей с использованием кассеты, нацеленной на ROSA26, экспрессирующей гРНК Y3 и Cre-зависимую эндонуклеазу Cas9. При транзиторной экспрессии рекомбиназы Cre в эмбриональных стволовых клетках таких животных происходила элиминация Y-хромосомы. Аналогичный подход был повторен с индуцируемой тамоксифеном рекомбиназой MerCreMer, что дало такой же эффект при обработке эмбриональных стволовых клеток 4-гидрокситамоксифеном. В эксперименте in vivo трансгенных мышей, экспрессирующих Cre-зависимую CRISPR-Cas9, скрестили с Sox2-Cre/+ мышами, которые экспрессируют Cre во всех эмбриональных линиях. В таком потомстве преобладали самки (64 процента), и половина Sox2-Cre-положительных самок имела кариотип X0.
Таким образом, сочетание удаления Y-хромосомы с помощью CRISPR-Cas9 и переноса ядер соматических клеток позволяет получить фертильное потомство обоих полов со стабильным геномом, используя только ядра самцов, включая криоконсервированные клетки. Генетически запрограммированная элиминация Y-хромосомы может стать основой для программируемой платформы, позволяющей преобразовывать пол эмбриона с мужского на женский, обеспечивая фертильных самок.
